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鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）是一種上皮性腫瘤，多發(fā)于有鱗狀上皮覆蓋的位置，比如皮膚、口腔等。其特征是組織極性的破壞和基底膜的入侵。
今天小編為大家介紹一篇2020年7月23日發(fā)表在Cell上的一篇利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(scRNA-Seq)、空間轉(zhuǎn)錄組(ST)和多重離子束成像技術(shù)(MIBI)，深入探究并揭示了人鱗狀細(xì)胞癌的組織構(gòu)造、細(xì)胞亞群以及基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
樣本信息：皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織
實(shí)驗(yàn)分組：scRNA-seq：腫瘤和匹配的正常皮膚（n=10）
ST：腫瘤樣本（n=4 ST+2 Visium）
單細(xì)胞捕獲平臺(tái)：10X Genomics 平臺(tái)
細(xì)胞數(shù)量：共48,164個(gè)細(xì)胞 /4個(gè)ST樣本---12張切片8179 spots/2個(gè)visium樣本---4張切片8885 spots
分析思路：
研究者通過(guò)對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）和匹配的正常皮膚的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和多重離子束成像確定了鱗狀皮膚癌的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄映射的配體-受體網(wǎng)絡(luò)和特定細(xì)胞類(lèi)型數(shù)據(jù)的整合揭示了主要位于生長(zhǎng)腫瘤前沿的腫瘤特異性膠質(zhì)細(xì)胞（TSKs）是細(xì)胞間通訊的樞紐，它們表達(dá)的基因能夠招募特定的細(xì)胞群體。最后利用人類(lèi)腫瘤異種移植物的單細(xì)胞特性和體內(nèi)CRISPR篩選確定了在腫瘤發(fā)生中起重要作用的特定腫瘤亞群富集基因網(wǎng)絡(luò)。這些數(shù)據(jù)定義了cSCC腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞亞群，它們相互作用的空間微環(huán)境以及在腫瘤中參與的通訊基因網(wǎng)絡(luò)。
接下來(lái)，小編將從以下5個(gè)方面為大家詳細(xì)介紹一下這篇文章中的主要研究成果。
研究者通過(guò)對(duì)cSCC和匹配的正常皮膚進(jìn)行t-SNE分析，并將細(xì)胞類(lèi)型鑒定為表皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞、NK/T細(xì)胞等7類(lèi)，又將髓系和NK/T進(jìn)一步細(xì)分。并從樣本來(lái)源、正常vs.腫瘤組織、細(xì)胞數(shù)量等角度進(jìn)行了細(xì)胞亞群占比分析。（圖1B-F）
圖1 cSCC和正常皮膚的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞圖譜
研究者分離出正常皮膚和cSCC的上皮細(xì)胞進(jìn)一步分群，發(fā)現(xiàn)除了正常的基底細(xì)胞、細(xì)胞周期的細(xì)胞和分化細(xì)胞之外，腫瘤有一個(gè)特異的MMP10+和PTHLH+細(xì)胞亞群（TSK）（圖2A-D）。通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)TSKs標(biāo)記基因與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞外基質(zhì)分解有關(guān)（圖2E）。TSKs還高表達(dá)了經(jīng)典的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記基因（圖2F-G）。與之前對(duì)口咽鱗狀細(xì)胞癌的研究結(jié)果類(lèi)似，EMT樣TSK細(xì)胞缺乏經(jīng)典的EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（圖2H）。通過(guò)SECNIC分析發(fā)現(xiàn)AP1和ETS家族轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控了TSKs（圖2I）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)cSCC的基底細(xì)胞的增殖頻率大約是正常組織的5倍（圖2J-K）。
圖2 TSKs異常的分化層次
這些數(shù)據(jù)都指向了cSCC的表皮分化層次在關(guān)鍵方面的失調(diào)，包括：(1)未能充分參與分化，(2)基底細(xì)胞快速增殖，(3)表達(dá)EMT相關(guān)基因的TSK亞群的出現(xiàn)。
研究者首先展示了不同患者切片HE染色和分群結(jié)果，并計(jì)算了不同cluster的sc-TSK score（Scoring spots in each section with TSK-signature genes from scRNA-seq），對(duì)TSK的特異性marker MMP10進(jìn)行染色，確定了TSK細(xì)胞在不同患者的空間位置（圖3A-C，圖3J-K）。在具有清晰前緣的腫瘤里，TSK臨近基質(zhì)富集了CAF和內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本，說(shuō)明TSK細(xì)胞主要位于纖維血管微環(huán)境（圖3D）。TSK score高的亞群80%位于腫瘤前緣，其余的前緣點(diǎn)陣富集了基底細(xì)胞（basal）（圖3E-F）。免疫組化染色(IHC)結(jié)果進(jìn)一步支持腫瘤基底細(xì)胞和TSK細(xì)胞在前緣的存在（圖3G-H）。此外，炎癥反應(yīng)和干擾素信號(hào)基因在非TSK前緣表達(dá)，與干擾素相關(guān)轉(zhuǎn)錄本在腫瘤基底亞群中的存在一致（圖3E,圖3I）。總之這些結(jié)果都說(shuō)明了TSKs和基底腫瘤細(xì)胞還有TSK臨近纖維血管生態(tài)位組成了cSCC腫瘤前緣的異質(zhì)性。
圖3 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示TSKs前緣異質(zhì)性
為了探究不同的細(xì)胞類(lèi)型如何影響cSCC的免疫活性，研究者檢測(cè)了一些已知免疫抑制基因的表達(dá)（圖4A），并發(fā)現(xiàn)這些基因表達(dá)與特定細(xì)胞類(lèi)型的位置一致。耗竭的CD4+T和CD8+T細(xì)胞除了表達(dá)耗竭的marker和相關(guān)抑制性受體之外，還會(huì)表達(dá)細(xì)胞毒性基因（圖4D）。T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本在空間位置上出現(xiàn)在炎癥前緣和免疫相關(guān)細(xì)胞亞群（圖4E）。緊接著，作者通過(guò)分析趨化因子和受體在scRNA-seq中的表達(dá)來(lái)評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的潛在招募機(jī)制。發(fā)現(xiàn)多個(gè)趨化因子受體在多種細(xì)胞類(lèi)型中同時(shí)表達(dá)，例如CXCR3 (Treg, CD8+ TEM), CXCR6 (Treg, CD4+
RGCC+, and CD8+ 耗竭細(xì)胞), CXCR4 (CD4+ RGCC+,CD8+ TEM, CD8+ TEMRA, and NK cells)，暗示這些細(xì)胞會(huì)被同時(shí)招募，并與他們?cè)诳臻g上共定位的結(jié)果一致。另外，Treg特異性表達(dá)CCR8, 提出這可能是一個(gè)抑制Treg招募的潛在治療靶點(diǎn)（圖4F）。這些結(jié)果展示了參與免疫抑制機(jī)制的多種細(xì)胞類(lèi)型，包括誘導(dǎo)DCs和耗竭T細(xì)胞的共抑制信號(hào)以及Treg的招募。
圖4 cSCC的免疫景觀
研究者使用MIBI技術(shù)對(duì)6位患者的腫瘤前緣進(jìn)行了18個(gè)視野的掃描，聚類(lèi)分析得到與scRNA-seq相似的主要細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)和免疫組成在腫瘤內(nèi)部和不同腫瘤樣本之間都具有異質(zhì)性（圖5A-C），但深入分析顯示CD8+T細(xì)胞、Treg、巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞高度相關(guān)；CD8+T細(xì)胞與Treg的聯(lián)系尤為緊密（圖5D）。5/12 視野提供了足夠的細(xì)胞進(jìn)行Treg and CD8+T細(xì)胞共定位的分析，并發(fā)現(xiàn)雖然CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也與Treg相關(guān)，但與CD8+T細(xì)胞相比，它們?cè)诓煌曇爸信cTreg共定位（圖5E-I）。成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Treg在腫瘤-間質(zhì)邊界最為豐富，而CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大部分被排除在腫瘤之外，說(shuō)明Treg可能阻止效應(yīng)淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤（圖5J-K）。B細(xì)胞被證明可以介導(dǎo)免疫抑制或抗腫瘤活性，是唯一表現(xiàn)出優(yōu)先浸潤(rùn)的細(xì)胞類(lèi)型（圖5L）。
圖5 cSCC中淋巴細(xì)胞亞群的空間結(jié)構(gòu)
接下來(lái)，作者整合了scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)，以展示臨近腫瘤前緣和TME細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖6A）。基于配體-受體對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，TSKs主要與CAFs、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和MDSCs參與廣泛的自分泌和旁分泌相互作用（圖6B-C）。與TSK -纖維血管生態(tài)位一致， TSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到CAFs是由幾對(duì)顯著的TSK- CAF配體-受體介導(dǎo)的，包括MMP9-LRP1和TNC-SDC1（圖6D-E）。相反，內(nèi)皮細(xì)胞和CAFs顯著地共同表達(dá)了配體，如TFPI、FN1和THBS1，與TSK受體匹配（圖6F-G）。作者接下來(lái)從兩個(gè)方面探索了TSKs配體是否能夠誘導(dǎo)CAFs基因：（1）隨著配體CNV的下降，腫瘤內(nèi)CAFs基因的表達(dá)降低；（2）配體和CAFs基因的表達(dá)有相關(guān)性（圖6H）。雖然需要做更多的工作來(lái)了解這一發(fā)現(xiàn)是因?yàn)門(mén)SKs的內(nèi)在抵抗還是免疫調(diào)節(jié)活性，但可以確定的是這個(gè)亞群可能提供了改善免疫治療的新方向。
圖6 與前緣生態(tài)位相關(guān)的細(xì)胞串?dāng)_景觀
研究者使用小鼠模型進(jìn)行腫瘤亞群基因的功能評(píng)估并進(jìn)行了scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)異種移植的SCC細(xì)胞亞型和患者基本一致（圖7A-C）。對(duì)來(lái)自患者和異種移植數(shù)據(jù)的類(lèi)似TME細(xì)胞類(lèi)型的比較也顯示了人類(lèi)和小鼠之間的共享標(biāo)記的高度重疊，在異種移植中只有髓系細(xì)胞類(lèi)型有一些細(xì)微差別（圖7D-E）。利用患者腫瘤亞群特征對(duì)體外培養(yǎng)的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞在基底細(xì)胞、細(xì)胞周期的細(xì)胞和TSK score上的異質(zhì)性很小，這與腫瘤細(xì)胞亞群的出現(xiàn)需要TME一致（圖7F）。同時(shí)，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合TCGA分析突出了可能控制亞群特異性致瘤功能的關(guān)鍵基因。
圖7 腫瘤角化細(xì)胞缺陷的體內(nèi)CRISPR分析
綜上所述，本研究使用scRNA-seq構(gòu)建了cSCC細(xì)胞亞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，并與ST和MIBI集成空間圖譜評(píng)估了這些細(xì)胞的微環(huán)境。多種分析手段的結(jié)合能夠幫助我們?cè)讷@得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的同時(shí)，獲得細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)上的具體位置。進(jìn)一步探索細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用以及整個(gè)微環(huán)境的變化。
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